在生物化工領域中，酶催化反應因其高效性和對合成環境的相對寬容性而聞名，常用于合成和加工經濟價值高且難以通過傳統化學合成途徑獲取的化合物。然而，酶催化反應所需的活性酶往往價格不菲，且在傳統合成流程中不易分離，這不僅造成了資源的嚴重浪費，還使得酶催化流程的成本控制成為一大挑戰。因此，學術界致力于探索將活性酶負載于催化載體的方法，通過構建連續催化反應器，使反應物連續流經并接觸載體上的活性酶，從而實現連續化生產。這一方法避免了酶直接進入反應液，省去了后續的分離步驟，提高了酶的利用效率和經濟性。但此模式亦存在加工效率不高的問題，原因是酶未直接置于體系中，與反應物的接觸面積受限，使得合成效率不及直接在體系中分散酶的方法。
3D打印技術的興起為生物基連續催化反應器的制造帶來了新契機。該技術允許用戶精確制備催化載體的三維空間結構，從而載體中的活性酶與反應物的接觸面積，進而提升反應器的生產效率。近年來，已有研究通過將活性酶催化劑固定于高分子水凝膠網絡中的方法，成功制造了有催化活性的載體結構。然而，這類結構所面臨的一個主要挑戰是反應物難以充分接觸載體內部的活性酶：由于受限于基材的擴散性能，往往僅有表面的酶能有效地發揮催化作用，導致內部酶的利用不充分。
針對這一問題，來自諾丁漢大學的研究團隊采用摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）3D打印技術及創新的水凝膠配方，在保持催化酶活性的前提下，成功制造出精度高達10 μm的精細催化載體結構。這一突破顯著增強了催化載體與反應物的接觸，進而提升了整個系統的催化效率。相關成果以“High resolution 3D printed biocatalytic reactor core with optimized efficiency for continuous flow synthesis"為題發表在期刊《Chemical Engineering Science》上。
該文章中的生物催化反應器芯是利用摩方精密nanoArch® S130（精度：2 μm）3D打印設備直接打印加工而成。文中使用的光固化配方由聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），苯基磷酸鋰（LAP），檸檬黃和β-半乳糖苷酶配置而成，能夠實現最小10 μm的孔道結構，并具有高保真度的最小50 μm的方形流道。相較于無流道結構，通過PμSL技術加工的三維酶基催化劑實現了提升催化效率，可達60%，并且通過將靜態反應器修改成動態連續反應器的方式，整個動態催化系統的催化效率相較于靜態催化系統提高了240%。
圖1. 生物催化活性3D打印反應器核心，具有精確控制的拓撲結構。a）用于樹脂的試劑的化學結構。b）面投影微立體光刻（PµSL）。c） 甲基丙烯酸硅烷化硅基板在打印過程中與3D打印的反應器核心共價結合，防止打印中途脫落。打印后，硅基板可輕松從平臺上分離。d）3D打印的微米級通道壁厚w和邊長p的水凝膠示意圖。酶在打印過程中被原位捕獲在納米級聚合物網絡中（PEGDA 700的長度為4.7 nm）。e）不使用硅烷化基板進行3D打印的示例。打印過程中從構建平臺上脫落并粘附到膜上，導致保真度差。f）剛打印出的空氣中的嵌入式酶（β-半乳糖苷酶）3D打印水凝膠（2 mm立方體，p=150 µm, w=100 µm，帶有7×7個水平對齊的通道）。在硅烷化基板上打印。g）打印件從平臺分離并浸入水中。h）具有優異分辨率的高保真通道（可實現的最小通道尺寸為10 µm）。
實驗表明，β-半乳糖苷酶在未固化的聚乙二醇二丙烯酸酯中暴露160分鐘后，仍能保留80±10%的活性。同時，通過測量打印件浸泡在緩沖液中上清液的活性發現，β-Gal被水凝膠包裹后幾乎沒有滲出，這進一步證明了該方法的有效性。
團隊人員在非流動條件下對含β-半乳糖苷酶的催化結構活性進行了初步評估。以邊長為2 mm的立方體、水平排列7×7 通道（通道寬度150μm、壁厚100 μm）的反應器核心為例。分光光度法結果顯示，420 nm處含酶的反應器核心產生的產物信號明顯強于不含酶的樣本，證明了該反應器核心用于酶催化的可行性。
圖2. 通過靜態分析確定 3D 打印反應核心的酶活性。a）首先在無流動的小瓶中對 3D 打印反應核心進行分析。b ）反應的展開示意圖。底物ONPG在3D打印反應堆芯內嵌入的 β-半乳糖苷酶的催化下發生水解，產生半乳糖和ONP。其中，ONP的吸光度用于量化酶活性。c ）分光光度計測試結果表明，嵌入酶的3D打印反應核心與不嵌入酶的3D打印反應核心相比，產品信號顯著。具有代表性反應核心部件參數為邊長為2 mm立方體，p=150 µm，w=100 µm，水平排列7 × 7 通道。各測試三個樣本，p < 0.001。誤差線表示平均值的標準誤差 (sem)。
隨后，文章探討了不同打印結構對反應器性能的影響。以無通道的立方體為參考樣本，結果表明隨著催化結構的邊長增加，比活性和合成速率均降低。這是因為催化核心尺寸增大時，位于中心區域的酶與反應物之間的擴散路徑變長，導致酶的利用效率降低，同時產物擴散也受到阻礙。這表明傳統無通道反應器在擴大規模生產的過程中，若不解決酶活性中心的可及性問題，增加體積會導致產量迅速達到瓶頸。
基于上述現象，為進一步改善反應物擴散和酶可及性問題，團隊嘗試在反應器核心中設計通道。初步固定通道寬度為24 μm，改變反應器核心的壁厚度（24 μm - 480 μm），觀察到壁厚從480 μm減小到24 μm時，比活性提高約40%，其中壁厚度小于100 μm 時提升尤為顯著。而這一尺度是傳統3D打印難以實現的，再次證明PμSL技術運用于該類結構的生產優勢。實驗觀察到合成速率并未隨壁厚度減小而顯著增加，這是因為減小壁厚度雖縮短了擴散路徑提高了合成速率，但也減少了酶的總質量，二者存在權衡關系。進一步的研究表明，固定壁厚度為24 μm，改變通道寬度（24 μm- 96 μm）時，比活性增加15%，原因是較大通道利于熱對流，使底物更快到達水凝膠中心，從而增加了底物與酶的接觸機會。然而，合成速率卻下降了43%，主要原因為通道尺寸增大導致打印水凝膠體積減小，進而使得酶質量隨之減少。
綜合實驗結果，為了比活性，采用薄通道壁和大孔隙組合可使比活性提高60% ，但就會導致在流動條件下大孔隙重要性降低。而對于小型反應器核心而言，較小孔隙和增加酶質量更利于提高合成速率。此外，分析表明比活性和合成速率與宏觀表面積相關性較差，高分辨率3D打印可精確控制分子在水凝膠中擴散的最大路徑長度，進而優化生物催化反應器性能。
圖3. 通過改變通道尺寸和壁厚提高反應器核心的效率。a）增加3D打印立方體的尺寸導致比活度（b）和合成速率（c）均下降。水凝膠立方體的尺寸范圍為L=1.25至2.0 mm，并含有嵌入的β -Gal。d ）將通道間壁厚從w=480降低至24 μm，可使反應器核心效率提高約50%，比活性變化結果如（e）所示，合成速率（f）在此范圍內略有增加。立方體尺寸固定在L=2.0 mm，孔徑固定在24 μm。g ）將通道寬度從p=24增加至96 μm，提升反應器核心效率，如比活性（h）的結果，但合成速率降低（i）。誤差線代表平均值的標準誤差 (sem)，各重復三次。
接下來，團隊設計并打印了一套完整的連續流反應器。組裝完成后，研究人員先以50 μL/min 的流速將500 μL反應物溶液注入反應器，并重復9次循環。實驗初期，由于反應器需要時間建立穩定的反應物和產物流動狀態，輸出的比活性較低（0.16 μmol·min-1·mg-1）。但隨著循環次數的增加，反應器逐漸達到穩態，比活性也逐漸升高，最終達到約0.8 μmol·min-1·mg-1并趨于穩定。在比活性穩定后，文章進一步探究流速對反應器性能的影響。控制流速在 25-1000 μL/min 范圍內并保持500 µL的反應物總量。實驗結果表明比活性隨著流速的增加而不斷提高。當最高流速1000 μL/min時，比活性達到 7.0 μmol·min-1·mg-1，相比靜態實驗中獲得的最高比活性提高了200% 以上，且有效因子達到64%。這一結果與前期文獻中使用的3D擠出法（<7%）和3D噴射法（21.2%）的結果相比，有顯著的提升。合成速率也呈現出隨流速增加而上升的趨勢。在流速為1 mL/min 時，合成速率，達到最大值0.29 μg·min-1·mm-3，相比靜態實驗提高了240%。綜上所述，在低轉化率下，比活性/合成速率與流速呈線性比例關系，由于底物在主體流動中的濃度相對穩定，流速成為控制合成速率的關鍵因素。但仍存在大量試劑未反應就流過通道的問題。這也表明當前反應器在底物利用效率方面還有提升的空間。
圖4. 3D打印的連續生物催化流動反應器。a）流動反應器裝置示意圖。使用注射泵可以實現可控流速將底物分子注入 3D 打印生物催化反應器。溫度由設定值控制的水浴槽精確控制。b）流動反應器的放大示意圖，顯示了反應器核心內嵌入的反應酶（β-半乳糖苷酶）。當底物ONPG流過反應器核心時，會得到產物半乳糖和 ONP。c）流動反應器外殼的CAD文件，其中箭頭表示流動方向。d） CAD文件顯示了集成反應器核心與反應器外殼的結構。e） 3D打印產出的反應器核心（PµSL）集成到3D打印反應器外殼（AnyCubic）中。f） β-半乳糖苷酶的比活性在重復循環后起初表現出增加趨勢，然后開始走向平穩，其循環周期為兩小時。g）1 次循環是 500 µL反應溶液以 50 µL/min的速率注入。h）流速增加，比活性和合成速率也增加。
總結：該研究運用高精度面投影微立體光刻 (PμSL) 3D 打印技術，打印高分辨率 (10 μm)、高保真、酶活性水凝膠反應器核心。相較于無通道的3D打印部件，該結構成功將比活性提升60%，在小于100 μm 尺度實現效率突破，證明高分辨率3D打印可優化反應器性能。同時，構建的3D打印連續生物催化流動反應器性能突出。在最高流速下合成速率相比靜態實驗提升240%，有效因子達64%。并且，小型反應器理論的時空產率較好，滿足商業高價值產品生產要求，若能放大規模，有望推動藥物制造向更可持續的方向發展，為生物催化領域帶來新的突破。
更新時間：2025-02-10
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